上海京剧院诞生于1955年8月24日。它是由华东戏曲研究院所属京剧实验剧团（简称“华东京剧实验剧团”）和上海人民京剧团合并组建而成。
1954年秋，华东大区建制宣布撤销。华东戏曲研究院决定划归上海市，改建上海京剧院、上海越剧院和上海市戏曲学校三个事业单位。1955年春节前后，华东戏曲研究院干部吴石坚、陶雄，上海人民京剧团干部林鹏程以及新从福建调来的该省京剧团干部丁国岑，受命开始筹备建院工作。
华东京剧实验剧团原名华东平剧团，1949年随军南下，进驻上海，改称华东京剧团，与原第三野战军部文艺工作团第三团（简称“三野文工三团”）合并，于1951年3月划归新建的华东戏曲研究院领导，改名京剧实验剧团。它的前身可以远溯到1940年冬成立的山东省文协实验剧团，1947年1月与北撤至临沂的苏皖实验剧团合并，同年冬复与渤海行署宣传平剧队合并，改编为华东平剧团，隶属华东军区部。三野文工三团的前身也可远溯到1945年成立的苏皖实验剧团第二团，北撤后，于1946年冬改名“娃娃剧团”，隶属华中野战军部，1947年春，改编为华中野战军部文艺工作团第四队，1948年春再改为华东军区、第三野战军部文艺工作团第三团，渡江后，于1949年6月，将原夏声戏剧学校并入，再与原华东京剧团合并，成为华东戏曲研究院所属京剧实验剧团。
上海人民京剧团建立于1950年初，是上海市文化局接管原大舞台班底后邀聘海派知名京剧演员多人组建而成。
经过两介月左右的匆促筹备，1955年3月24日下午，上海市文化局在长江剧场召开上海京剧院、上海越剧院成立大会，由主要负责的副局长陈虞孙宣布：任原华东戏曲研究院院长的周信芳为上海京剧院院长，原该院副院长袁雪芬为上海越剧院院长。并委托吴石坚、丁国岑、陶雄、吕君樵、林鹏程组成“五人小组’’，负责处理京剧院组建具体事项，由吴石坚总其成。
此际，上海京剧院人才荟萃，流派纷呈，拥有主要演员李玉茹、王金璐、陈大濩、陈正薇、金素雯、沈金波、张美娟、刘斌昆、汪志奎（以上原华东团）、纪玉良、王熙春、李仲林，赵晓岚、王正屏，袁灵云，李桐森（以上原上海团）等数十人。筹备建院期间，童芷苓已加入上海人民京剧团；随后俞振飞自港归来，也隶属上海京剧院（旋调任上海市戏曲学校校长），盖叫天一度兼任上海京剧院顾问。1957年初，言慧珠也由上海新民京剧团调至上海京剧院（随后又调任上海市戏曲学校副校长）。其他，各行各科，也都人材济济，配搭齐整。
乐队方面，江南主要鼓师王燮元、张鑫海、张森林，主要琴师查长生、沈雁西、马锦良、黎秋觉、郝德泉等都先后加入了上海京剧院的行列。编剧有郑剑西、陈西汀、吕仲、苏雪安、刘梦德、许铁生等。导演有吕君樵、洪谟、刘静沅等。舞美设计有幸熙、周楚江等。音乐设计有倪秋萍。可是，建院后最重要的分团工作却一时无从进行。为了赴京参加文化部、中国文联、中国剧协举办的“梅兰芳、周信芳舞台生活五十年纪念”演出活动，根据剧目的需要，院当局安排了最强的阵容，随周信芳院长北上，分团工作只得暂时搁置下来。
两院成立大会的次日，京剧院参加梅、周纪念活动的大队随即出发，在京滞留约一个半月，演出结束后，极大部分人员又于5月初随周院长巡回演出，遍及华北、东北，华东五个省的十个城市，历时八个月，年底始返沪。
紧接着，1956年初，上海京剧院又接受了新的任务，投入周信芳代表作《宋士杰》电影的摄制工作。夏初，影片刚完成，院方就又抽调了七、八十人的一个演出队，于8月间赴京准备访苏演出的剧目。10月下旬，上海京剧院访苏演出团在周院长和原华东戏曲研究院副秘书长伊兵率领下，启程出国。在苏联访问了莫斯科、列宁格勒、塔林、里加、考那斯、维尔纽斯，明斯克、高美里、基辅等九个城市，上演了大小二十个剧目，手1957年1月回国返沪。
在此期间，留沪人员临时编组，积极排演了一些剧目，其中有李玉茹、俞振飞的《周仁献嫂》，童芷苓的《玉簪记》，李仲林、童芷苓的《猎虎记》，纪玉良、陈正薇的《打金枝》，陈大濩的《中山狼》，金素雯的《孔雀东南飞》等。质量不差，但影响不大。
同期，运动较多。1955年的“反胡风斗争”,1956年的肃清反运动，都是压倒一切的重大任务。1956年夏，以童芷苓、李仲林为首的部分演员又参加中国艺术团，赴东欧各国访问演出。
由于临时任务接连不断，人员分散，组团工作一直未能进行，对于全院正常开展业务颇多影响。
1957年2月，两个出国团先后回国，全院四百余人齐集沪上。为了更好地、更有效地进行确定方针、健全体制之根本大计的工作，上海市文化局宣布先行展开“建院学习”，发动群众对院领导提意见，揭露矛盾，献计献策。“建院学习”由陈虞孙副局长亲自挂帅，局的有关处长刘厚生、许平、周旋具体领导。
这是一次发扬的大规模的群众运动，从主要艺术人员，到基层演职员工，人人发表意见，所上条陈，数以千计。其中，有关于方针任务的，有关于体制机构的，有关于艺术生产的，也有属于干部作风的。
1957年5月，“反斗争”前夕，上海市文化局宣布上海京剧院“建院学习”结束。
在总结大会上，正式宣布吴石坚为副院长，丁国岑、陶雄为院长助理（后丁、陶二人均提升为副院长），丁国岑兼办公室主任，陶雄兼艺术室主任。院下分设三个团，一团以演连台本戏为主，二团以演老戏和本戏为主，三团以培养青年为主，人员基本固定，也留有机动余地。
至此，长达两年多的建院工作终于完成，上海京剧院宣告正式建成了。